ブックタイトル日本結晶学会誌Vol62No2

概要

日本結晶学会誌Vol62No2

生命科学の飛躍のために一層深まるタンパク質結晶学の役割～タンパク質の超高分解能電荷密度解析る．A型では発色団はプロトン化されて中性であるが，B型では脱プロトン化されて陰イオンとなっていると考えられている．野生型GFPでは可視域に2つの吸収ピークが存在するが，398 nmの吸収ピークはA型の発色団に，475 nmのピークはB型の発色団に由来する（図1b）．GFPの発色団の2つの状態間では，周辺残基との間の相互作用様式が異なる．B型を選択的に蓄積する変異体としてS65TやE222Qなどが知られている．これらのB型変異体では野生型GFPよりも蛍光強度が増大しており，応用研究において有用である．GFPおよびその変異体において発色団の電子構造は周辺アミノ酸との相互作用に強く影響を受けるため，量子化学計算にとっても興味深い研究対象であり数多くの研究結果が蓄積されている．また，GFPおよび類似の蛍光タンパク質群は遺伝子発現および発現タンパク質の局在をモニターするためのツールとして現在の分子生物学に不可欠であり，信頼性の高い構造情報は分光特性を理解して改良に役立てるために非常に重要となる．きなビームも利用できる（図2b）．超高分解能データ収集に用いられる結晶は多くの場合大きくて全体が均質であるため，光子密度を低くして広範囲に照射することでX線損傷を抑制することができる．BL41XUの通常モードにおいて使用しているEIGER検出器の場合，波長0.35 AのX線の多くは透過してしまう．しかしここ数年で高エネルギーX線に対する感度が高い化合物半導体CdTeを用いた二次元検出器が利用可能となり，本研究でも光子計数型ピクセルアレイ検出器PILATUS3 X CdTe 300Kを使用することができた．12）GFPのデータ収集条件を表S1に示す．波長0.35 A，ビームサ3．タンパク質の電荷密度解析の方法3.1実験試料の準備GFPのE222Q変異体では，発色団はB型が安定化されていることが分光学的な研究から示されている（図1b）．10）このE222Q変異を含む高収量変異体（F99S/M153T/V163A/E222Q）を大腸菌により発現して研究に用いた．結晶については，ハンギングドロップ蒸気拡散法で得た針状結晶をマイクロシード法およびマクロシード法によって成長させることで大型（1,500×300×300μm 3）のものを用意した．この結晶を，抗凍結処理を施した後に100 Kの窒素ガス気流中で瞬間冷却して，回折実験に使用するまで液体窒素中で保存した．3.2超高分解能回折データの収集超高分解能回折データ収集はSPring-8の構造生物学ビームラインBL41XUで行った．11）BL41XUでは0.7～1.9 Aの波長を用いる通常モードに加えて，0.35～0.6 Aの波長を利用する高エネルギーモードを運用している．高エネルギー（短波長）のX線は，この領域に吸収端をもつI（33.17 keV）やXe（34.56 keV）などの元素の位置決定やそれらを用いた位相決定，および超高分解能回折データ収集などに有用である．このような高エネルギーX線を用いたタンパク質結晶の回折データ収集ができるのは国内ではBL41XUだけであり，海外でもあまり例がない．このビームラインに2つある実験ハッチのうち，通常モードでは下流側の実験ハッチ2を，高エネルギーモードでは上流側の実験ハッチ1を利用する（図2a）．X線レンズを用いて集光した10×10～50×50μm 2のビームが利用可能であるほか，集光学系を通さずに4象限スリットで成形した50×50～300×300μm 2のサイズの大日本結晶学会誌第62巻第2号（2020）図2 SPring-8 BL41XU．（Beamline BL41XU at SPring-8.）（a）GFPの回折データ収集に使用した高エネルギーX線用回折計（写真は理化学研究所上野剛博士提供）．本研究には83.8×106.5 mm 2の受光面をもつPILATUS3 X CdTe 300K（DECTRIS社製）を使用したが，現在ではさらに広い受光面（168.7×179.4 mm 2）をもつPILATUS3 X CdTe 1Mを使用することも可能となっている（BL02B1より借用）．（b）BL41XUのビーム強度．ビームサイズは横×縦を示す．X線レンズは20，25，30 keV用の3種類が設置されている．＊表S1は, J-Stageの電子付録（Supplementary）をご参照下さい.107