ブックタイトル日本結晶学会誌Vol61No4

概要

日本結晶学会誌Vol61No4

日本結晶学会誌61，211-212（2019）最近の研究動向クライオ電子顕微鏡で明らかになったスルメイカヘモシアニン（TpH）の立体構造北里大学理学部松井崇鹿児島大学水産学部加藤早苗東北大学大学院生命科学研究科田中良和Takashi MATSUI, Sanae KATO and Yoshikazu TANAKA: Cryo-EM Analysis Revealsthe Asymmetric Assembly of the Todarodes pacificus Hemocyanin（TpH）軟体動物の酸素運搬タンパク質であるヘモシアニンは相同性の高い機能ドメイン（Functional unit，以後FUと表記）の繰り返しからなる350～450 kDaのポリペプチド鎖の多量体である．イカなどの頭足類のヘモシアニンは10量体を形成し，分子量は約3.5～4.5 MDaにも及ぶ．ヘモシアニンは巨大なタンパク質会合体であることから，主に電子顕微鏡により構造が解析され，N末端側の6個のFU（FU-aからf）によりシリンダー構造のD 5対称な外壁領域が形成され，残りのC末端側FUにより内部領域が形成されることが明らかになっている．1）,2）一方，外壁領域を構成するFUの1つであるFU-dが遺伝子重複したFU-d*をもつスルメイカのヘモシアニン（TpH，ドメイン構造：FU-a，b，c，d，d*，e，f，g）はX線結晶構造解析で全体構造が決定された．結晶構造解析により，TpHはD 5対称の外壁領域と，FU-d*とFU-gからなるC 5対称の内部領域を有していると結論された．3）,4）また，結晶中では上下反転したヘモシアニンが50％の割合で混在していたため，疑似のD 5対称をもった電子密度が観測され，そのため内部領域の詳細な構造を決定するのは困難であった．そこで，われわれはクライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）による単粒子構造解析により，TpHの内部領域が非対称な構造を有することを明らかにした．5）本稿では，TpHの単粒子構造解析における工夫，TpHの内部構造，X線結晶構造解析で疑似のD 5対称性が観察された原因を紹介する．1．TpHの単粒子構造解析氷包埋したTpHはFALCON IIを装備したTITAN KRIOS（FEI，300kV）で測定した．MotionCor2でムービーアライメントした画像から抽出した粒子は，単粒子解析ソフトウェアSPHIRE 6）でTpHの二次元平均画像と三次元構造を構築した．負染色電子顕微鏡画像と結晶構造の特徴から，TpHがC 5対称をもつ分子であると仮定し，Cryo-EM画像からTpHの三次元初期構造を計算した．しかし，この初期構日本結晶学会誌第61巻第4号（2019）造はX線結晶構造と同様に，内部領域には上下対称な合計40個のFUが観測され（本来は20個），内部構造は不明瞭であった（図1a）．この結果から，C 5対称で解析した単粒子構造は外壁領域のD 5対称性により導かれた不正確な立体構造であると考えた．2．プログラムSPHIREによる構造解析対称性を利用した三次元初期構造計算では疑似的な対称性をもつ不正確な立体構造へと誘導されたため，C 1対称としてTpHの初期構造を計算した．その結果，D 5対称の外壁領域と非対称な20個のFUからなる内部領域が計算された（図1b）．しかし，単にC 1対称の分子として三次元精密化しただけでは正しい構造は得られなかった．すなわち，電子密度の75％を占めるD 5対称性をもつ外壁領域の微細な構造の歪みを重ね合わせるようにして各粒子の方位が決定されてしまい，内部構造は外壁領域の歪みの影響で不正確な方位に平均化され，その結果，強い異方性をもって特定の方向にのみ強い強度の電子密度を示す構造が得られたのである．そこで，われわれは，内部領域をマスクして外壁領域だけを取り出し，また，逆に外壁領域をマスクして内部領域を取り出した各構造のローカルな精密化を行った（図2）．さらに，外壁領域の対称性により誤った構造へと誘導されないようにするために，内部領域の電子密度の強度を1.5倍に強め，D 5対称の外壁領域と非対称な内部領域の構造を統合してさらなる精密化を行った．このローカルな精密化と全体構造の精密化を組み合わせた計算は，プログラムSPHIREのユーザーファンクションを用いて行った．この方法により外壁領域と内部領域で異なる対称性をもつTpHの構造を決定できた（図1c）．3．TpHの立体構造単粒子解析で解明されたTpHの立体構造は，D 5対称211