ブックタイトル日本結晶学会誌Vol57No3

概要

日本結晶学会誌Vol57No3

田中勲セレン置換タンパク質を利用したMAD法が急激に伸びている．この方法が普及して，今日，ルーチン解析法として使われているのは周知のとおりである．北大のわれわれの研究室でも，1990年代の初め頃から，この方法に取り組んだ．セレノメチオニンを使ったMAD法は，今でこそ多用されているが，初期の頃には，その汎用性について懐疑的な見方も多くあり，位相決定のために必要なSeの数，Se-Met置換の方法，Se-Met置換体の結晶化法，波長の選び方，バイフット対の測定法，位相計算法などについて，さまざまな議論があった．われわれも当時，試行錯誤を繰り返しながら，徐々にルーチン解析法としてのノウハウを蓄積していった．1）-6）2.1マクロファージ遊走阻止因子の解析Se-MAD法を使って最初に解析したのはラット由来マクロファージ遊走阻止因子である．1）Se-MAD法による初めての解析であったので，解析にあたってさまざまな試行錯誤があった．最大の関心事は，自分達の測定したデータが実際にSeからの小さな異常散乱シグナルをもっているかどうかであった．計算が早くなった今日では，解析の成否は電子密度図を計算して判断するのが一般的だが，当時はパターソン図が解釈できるかどうかで判断した．このタンパク質にはMetが3個あったが，最初に得られたバイフット差パターソン図は解釈できなかった．そこで，当時可能になっていたアミノ酸置換を行い，3個あるMetのうちの2個までをAlaに置換し，残った1個のMetをSe-Metにしたタンパク質を調製して構造解析を行った．これにより，非常にきれいなパターソン図が得られた（図3）．当時，このデータをもってヨーロッパのMADワークショップに参加したが，この図は，そのとき見たほかのどんなパターソン図よりもきれいだった．現在でもこれだけきれいなパターソンピークが得られるのは稀と思う．このデータは，フォトンファクトリーのMAD用ビームライン（BL18B）で収集したものだが，日本のビームラインが世界のどこにも引けをとっていないことを確信した．2.2 OmpRの解析OmpRは大腸菌の外膜タンパク質の発現を制御するDNA結合タンパク質である．その解析では，はじめに重原子同形置換体の調製を試みたが，結局役に立つものを得ることができなかったのでSe-MAD法に方針を転換したところ，それから数カ月で構造解析に成功した．2）このタンパク質は，分子中に5個のMetをもっているが，ハーカーセクションには，5個のSeの自己ベクトルのうちの3個しか見えていない（図4）．それにもかかわらず構造が決定できたという経験から，この方法は近い将来，ルーチン的に使われるようになると確信した．2.3リボソームタンパク質の網羅的構造解析リボソームは，DNA上の遺伝情報をもとにmRNAを介してタンパク質を合成する細胞内小器官である．原核生物のリボソームは，大小2つのサブユニット（沈降係数からそれぞれ50S，30Sサブユニットと呼ばれる）からなり，30Sサブユニットは16S RNAと20数個のタンパク質から，50Sサブユニットは23S RNA，5S RNAと30数個のタンパク質から構成されている．総分子量270万の2/3をRNAが，残りの1/3をタンパク質が占める．リボソームタンパク質は，50S由来のものはL，30S由来のものはSを頭につけて番号で呼ばれる．多くは低分子量の塩基性タンパク質である．50数個のタンパク質の間には一次構造上の類似性がほとんどなく，また興味深いことに，それらのタンパク質のほぼすべてが，リボソーム1個当たり1コピーだけ存在している．ただ1つの例外が，GTPase活性に関与するタンパク質で，これだけは複数コピー存在する．（真正細菌の場合L12と呼ばれ，通常4コピー存在し，古細菌の相当するタンパク質はP1と呼ばれ6コピー存在している（後述）．）リボソームは，すべての生命体が共通にもっている非yxyxV33V55V22V11V44図3ラット由来マクロファージ遊走阻止因子の構造解析（空間群P6 3）．（Structure analysis of macrophagemigration inhibitory factor from rat（space group P6 3）.）左：バイフット差パターソン図（z＝0）．3つあるMetのうちの2つまでをAlaに置き換えた変異体（M2A/M101A/Se-Met）を利用した．Se-Seピーク（矢印）は20σある．右：3量体のリボンモデル．図4大腸菌OmpRのDNA結合ドメインの構造解析（空間群P3 221）．（Structure analysis of DNA bindingdomain of OmpR from E. coli.（space group P3 221）.）左：バイフット差パターソン図（z＝1/3）．赤と緑の点は計算によるSe-Seベクトルの位置である．右：リボンモデル．（編集部注：カラーの図はオンライン版を参照下さい．）156日本結晶学会誌第57巻第3号（2015）