ブックタイトル日本結晶学会誌Vol57No2

概要

日本結晶学会誌Vol57No2

Cas9の結晶構造(a)NUC lobeNUC lobeNRuvC-IBHREC1REC2REC1RuvC-IIHNHRuvC-IIIPICREC lobe(b)Cas9(c)Cas95’3’非相補鎖DNA相補鎖DNA5’RuvCHNHTargetGuideNGGPAMcrRNA3’5’3’5’非相補鎖DNA5’3’相補鎖DNA5’RuvCHNHTargetGuideNGGPAM3’5’tracrRNAsgRNA図23’3’Cas9?crRNA?tracrRNACas9?sgRNACas9の機能．（Cas9function.）（a）Cas9のドメイン構造．（b）Cas9-crRNA-tracrRNAによる標的2本鎖DNA切断機構．（c）Cas9-sgRNAによる標的2本鎖DNA切断機構．Casタンパク質-crRNA複合体はcrRNAのもつガイド配列と相補的な標的核酸を認識し切断する．crRNAのもつガイド配列は過去に感染した外来核酸に由来するので，crRNAは分子記憶としてはたらき外来核酸の再感染を防ぐ．CRISPR-Casシステムは関与するCasタンパク質群，crRNA生合成機構や核酸分解機構の違いに基づきI～III型に分類される．II型CRISPR-CasシステムではCRISPR領域からcrRNA前駆体とtracrRNA（transactivatingcrRNA）が転写され，Cas9タンパク質と複合体を形成する4）（図1）．Cas9に取り込まれたcrRNA前駆体：tracrRNAはRNaseIIIによりプロセッシングされ，最終的に，Cas9-crRNA-tracrRNA複合体が標的2本鎖DNAを認識し切断する．3．Cas92012年，Cas9はRNA依存性DNAエンドヌクレアーゼであることが明らかになった．5）,6）Cas9は110～190 kDaのタンパク質で，2つの既知のヌクレアーゼ（RuvCとHNH）と相同な領域をもち，その他の領域は既知のタンパク質と配列相同性をもたない（図2a）．Cas9-crRNAtracrRNA複合体は，crRNAのもつ20塩基のガイド配列と相補的な標的2本鎖DNAを認識し切断する（図2b）．標的2本鎖DNAのうち，ガイド配列と相補的なDNA鎖（相補鎖DNA）はHNHドメインにより切断され，もう一方のDNA鎖（非相補鎖DNA）はRuvCドメインにより切断される．標的2本鎖DNAの切断には，ガイド配列との相補性に加え，標的配列の近傍の非相補鎖DNAが特定の塩基配列をもっていることが必要である（図2b）．こ日本結晶学会誌第57巻第2号（2015）の塩基配列はPAM（protospacer adjacent motif）と呼ばれ，生物種によって異なる．例えば，現在ゲノム編集に応用されている化膿レンサ球菌Streptococcus pyogenesに由来するCas9はNGG（Nは任意の塩基）をPAMとして認識する一方，Streptococcus thermophilusに由来するCas9はNGGNGをPAMとして認識する．crRNAとtracrRNAをリンカーでつないだsgRNA（single-guide RNA）もガイド鎖RNAとして機能する5）（図2c）．これは次に述べるCas9の応用において重要な性質である．4．Cas9を応用した革新技術生物はゲノムに生じた2本鎖DNA切断を修復する機構をもち，その修復過程において塩基の挿入や欠失などのエラーが偶発的に起こる．人工ヌクレアーゼを用いてゲノム中の標的部位に人為的に2本鎖DNA切断を引き起こし，その修復過程に生じるエラーを利用することによりゲノム情報を書き変える技術はゲノム編集と呼ばれ，新たな遺伝子改変技術として注目されている．7）,8）ゲノム編集にはこれまでZFN（zing finger nuclease）やTALEN（transcription activator-like effector nucleases）といった人工ヌクレアーゼが利用されていた．しかし，これらはDNA配列認識モジュールとDNA切断ドメインの融合タンパク質であるため，標的部位ごとにDNA配列認識モジュールをデザインしなければならないという問題点があった．それに対し，Cas9-sgRNAはRNA：DNA間の配列相補性を利用して標的DNA配列を認識し2本鎖DNA切断を引き起こすため，ZFNやTALENと比較して迅速・簡便なゲノム編集が可能であるという利点をもつ．Cas9が97