ブックタイトル日本結晶学会誌Vol56No3

概要

日本結晶学会誌Vol56No3

GHファミリー23に属する新奇キチナーゼの構造と機能図5Ra-ChiCの触媒反応機構の模式図.（Catalytic mechanismof Ra-ChiC.）くなり,水分子からプロトンを受け取るのに都合の良い性質を獲得していると考えられる.一方, Glu162にはこのような相互作用は見られない.したがって, Glu162が求核水を活性化する性質はAsp226よりも劣り, Glu162は求核水の位置の固定に寄与しているのではないかと考えられる.このような静電的相互作用はAcLYZにおいても観察されており,求核水と思われる水分子と水素結合を形成しているAsp90とAsp101のうち, Asp101のみが近接したArg103と相互作用を形成している.これにより,Asp101のほうが塩基触媒として都合の良い性質を獲得していると考えられる.さらに,ほかのファミリーに属するアノマー反転型酵素についても調べてみると, GHファミリー6や8に属するセルラーゼ（PDBコード：2BVW,1KWF）, GHファミリー46に属するキトサナーゼ（PDBコード：1CHK）など,複数の酵素の触媒残基において同様の相互作用が観測された.以上のことから,われわれはRa-ChiCの触媒反応においてはAsp226が塩基触媒として働くと結論付け,図5に示すようなRa-ChiCの反応機構を提唱した.5．Ra-ChiCの基質特異性発現機構リゾチームはペプチドグリカン中のN-アセチルムラミン酸（NAM）とNAGの間の結合を切断する酵素である.NAMはNAGのC3に乳酸基が付加した構造をしており,リゾチームとキチナーゼの基質の化学構造は類似している（図6A）.しかし,ガチョウ型リゾチームはNAG-NAG間の結合に対しても弱い切断活性を示すが,反対にRa-ChiCはリゾチーム活性をまったく示さない. 5)その理由はRa-ChiCに特徴的なトンネル構造にある.前述のように,Ra-ChiCの活性部位はα5とα6を繋ぐループL-7によって覆われ,トンネル構造を形成している.そのため, Ra-ChiCの活性中心の空間は狭い.一方,ガチョウ型リゾチームではRa-ChiCのL-7に対応するループは上に跳ね上がっており,その活性部位は開いた構造をしている（図3）.われわれは,このような構造の違いがRa-ChiCの基質特異性を創出していると考え,比較のためにRa-ChiCの活性中日本結晶学会誌第56巻第3号（2014）図6 Ra-ChiCのNAM結合モデル（Models of Ra-ChiC-NAM complex.）（A）キチナーゼとリゾチームの基質の化学構造.（B）Ra-ChiCの－1サブサイトにNAMが結合したモデル構造.（C）Ra-ChiCの＋1サブサイトにNAMが結合したモデル構造. Ra-ChiCとNAMの乳酸基との間の立体障害を白矢印で示す.心にNAM分子が結合したモデルを作製した.まず,E141Q-NAG4の構造中の－1サブサイトに結合しているNAG分子をそのままNAM分子のモデルに置き換えてみたところ, NAMの乳酸基とL-7との間に立体障害が生じた（図6B）. L-7は長いループであるため, NAMの結合に伴い構造変化を起こすことも考えられるが, L-7上には触媒残基であるAsp226が存在するため,ループの構造変化によりその配向が変わってしまい,たとえNAMが結合できたとしても反応を触媒することは難しいと考えられる.また,＋1サブサイトにNAMが結合したモデルも同様に作製したところ,今度はトンネルの底部との間に立体障害が生じた（図6C）.このように,このトンネル構造が, Ra-ChiCの基質特異性を決定する重要な役割を担っていると推察された.6．おわりに本研究では, GHファミリー23に属するキチナーゼRa-ChiCの結晶構造解析および変異体を用いた酵素活性測定を行い,その基質認識機構および触媒反応機構を明らかにした. Ra-ChiCの立体構造の中でも最も特徴的なのは,活性部位がトンネル構造をしているということである.このトンネル構造を構築するL-7には, GHファミリー23には保存されていない触媒残基Asp226が存在し, Ra-ChiCは独自の触媒残基の配置を有していることが明らかになった.さらに,このトンネル構造がRa-ChiCの基質特性を決205