ブックタイトル日本結晶学会誌Vol56No3

概要

日本結晶学会誌Vol56No3

伊藤弓弦,横山茂之る.一般に,大型のタンパク質の結晶構造解析は困難であり,低分解能の電子顕微鏡像は報告されていたが, 15)結晶構造は未知であった.2.2 SelAの結晶化と構造決定本研究では,細菌の一種Aquifex aeolicus由来のSelAの結晶化を行った. A. aeolicusはアメリカのイエローストーン国立公園の熱水噴出口から単離された細菌で, 90℃前後の水温で繁殖する超好熱性細菌である.進化の初期に分岐した種で,原始的な特徴を多く残していると考えられている.われわれは,セレノシステイン生合成の研究対象として, A. aeolicusの因子を中心に構造解析を試みてきた. 14) A. aeolicus SelAの遺伝子を大腸菌内で発現させて,精製,結晶化を行った. A. aeolicus SelAは結晶化しやすいタンパク質であったが,針状結晶になりやすく,三次元的な単結晶になりにくかった.また,大型の単結晶を作製しても,十分な分解能のX線回折を与えなかった. 16)これを解決するため,まず, SelAのN末端ドメインを削った変異体（SelA-?N）を作製した.さらに,リジン残基のメチル化処理を行うことで,分解能を向上させ, 3.2 Aの回折データを得た.一方,全長のSelAに関しては,リジンのメチル化のほか, N末端ドメインの4つのリジン残基をアラニンに変えた変異体を作製して結晶化したところ,分解能3.9 Aの回折データを得た.これらのリジン残基は,ほかの生物のSelAのアミノ酸配列と比較すると,保存されていないため,この変異体は野生型と同じ立体構造であると考えられる.位相はセレノメチオニン置換体を用いたセレンの多波長異常分散法で決定した.2.3 SelAの立体構造SelAは, 2量体が5個,星形に配列した10量体であることがわかった（図4）. 17) SelAの総分子量は500 kDaを超え, 10個のサブユニットは互いに同じ構造であるため正5角形様の対称性をもっている.各サブユニットはN末端ドメイン,コアドメイン, C末端ドメイン* 5からなり,コアドメインとC末端ドメインが星型を形成し,可動性のN末端ドメインは星型平面から上下に突き出ていた（図4）. 2量体はコアドメインを介した比較的弱い相互作用で5量体化しており,実際,相互作用面に点変異を導入することで10量体を形成しない, 2量体変異体が作製することができた. 17)触媒ポケットは10個あり, 2量体を形成するサブユニットの境界面に存在し, PLPを結合していた（図5）.＊4＊5サブユニット：タンパク質は1本のアミノ酸重合鎖（ポリペプチド鎖）からなるもの（単量体タンパク質）と,複数本の鎖からなるもの（多量体タンパク質）がある.多量体タンパク質を構成する各々のポリペプチド鎖をサブユニットと呼ぶ.ドメイン：ポリペプチド鎖がタンパク質として機能するために折りたたまれて特定の立体構造をとる.このとき,通常は全体が折りたたまれるのではなく,いくつかの領域に分かれ,それらを単位にして独立に折りたたまれる.この単位をドメインと呼ぶ.図4 SelAの結晶構造.（Crystal structures of SelA.）図5 SelAの活性部位.（Catalytic site of SelA.）PLPはSelAの触媒残基であるLys285と共有結合で結合しており, 10個の触媒部位の構造は互いに同じであった.SelA-?Nはチオ硫酸ナトリウムを含む結晶化溶液中で結晶化しており,触媒部位にはチオ硫酸イオンが結合していた.チオ硫酸はSelAの基質であるセレノリン酸と構造が似ているため,チオ硫酸の結合部位はセレノリン酸のそれを模していると考えられる.3．細菌のtRNA Secの結晶構造3.1背景tRNAはアミノ酸を結合するアダプター分子で,リボソームへアミノ酸を運ぶ.リボソームではmRNAのコドンとtRNAのアンチコドンが対合することで,コドンとtRNAが対応,さらにそれに結合したアミノ酸が対応づけられることでコドン→アミノ酸という「翻訳」が成り立っている.アミノ酸にはそれぞれのtRNAが存在し, Secにも専用のtRNAであるtRNA Secがある. tRNA Secは最大のtRNAで,通常のtRNAが75ヌクレオチド前後であるのに対し,真核生物／古細菌のtRNA Secは90～94ヌクレオチド,細菌のtRNA Secは95～100ヌクレオチドである.また, tRNA Secの二次構造はほかのtRNAと異なる点が多く（図2）,その立体構造は長らく謎であった. 2009年,われわれはヒトのtRNA Secの結晶構造を報告し, 12) 2010年にはPSTKとの複合体の状態で古細菌のtRNA Secの結晶構造を報告した. 13)これにより,真核生物／古細菌型のtRNA Secの立体構造が明らかになった.一方,細菌型のtRNA Secは真核生物／古細菌型のものと共通点は多いものの,二次構造に違いがあり,その立体構造は不明であった.3.2方法本研究では, A. aeolicus tRNA Secの結晶化を行った. A.188日本結晶学会誌第56巻第3号（2014）