ブックタイトル日本結晶学会誌Vol59No2-3

概要

日本結晶学会誌Vol59No2-3

日本結晶学会誌59，88-95（2017）解説タンパク質の電子線三次元結晶構造解析と電荷の精密化（国研）理化学研究所放射光科学総合研究センター米倉生体機構研究室米倉功治，眞木さおりKoji YONEKURA and Saori MAKI-YONEKURA: Electron 3D Crystallography ofProtein Structures and Refinement of ChargesElectron 3D crystallography is a useful method for structure analysis from tiny and thin crystalsof membrane proteins and protein complexes, which often yield crystals too small or too thin foreven the synchrotron X-ray beam and X-ray free electron laser. More importantly, it can visualizethe charged states of amino-acid residues and metals, as the diffraction pattern formed by elasticallyscattered electrons is directly related to the distribution of Coulomb potential. Here we introducethe development of this technique and structure determination with charges, and discuss furtherapplications including a suitable treatment of electron scattering factors of charged atoms.1．はじめに電子線は，X線に比べて4～5乗も強く物質と相互作用する.1）この性質により，X線回折に使えない微小で薄い結晶からでも，高い空間分解能まで回折点を測定できることがある．実際，好塩性古細菌の膜タンパク質バクテリオロドプシンが脂質平面膜に一層にのみ並んだ二次元の結晶から，3 A分解能を超える回折点が観測される.2）1990年，Hendersonらは，このプロトンポンプの構造を3.5 A分解能で決定することに成功した.2）同解析を通じて，電子線回折由来の振幅情報と実像由来の位相情報を組み合わせる二次元結晶構造解析の方法論が確立された.2）この成功を受け，これまでいろいろな試料で二次元結晶を作製する努力が続けられてきた．現在までに，膜タンパク質の理想的な二次元結晶から2Aより良い分解能の構造解析がなされているが,3）ある種の膜タンパク質を除いて，二次元結晶作製は容易ではないことがわかってきた．一方，数百nm以下の厚さの非常に薄い三次元結晶が得られることは経験上多い.4）-7）重要な生命機能を担う膜タンパク質や生体超分子複合体の結晶作製は難しく，微小な結晶やごく薄い三次元結晶でも構造解析に使用できれば，その利点は大きい．特に，膜タンパク質結晶は二次元的には大きく成長するが，数層の重なりにしかならないこともある．図1にいくつかのタンパク質の微小結晶の写真を示した．これらの結晶はX線回折には小さすぎたり薄すぎたりして，構造解析の対象にならなかった.6）,7）強力なシンクロトロン放射光やX線自由電子レーザーの強いX線を用いても，タンパク質などの巨大分子の回折測定には，数μm 3以上，一般に数十～100μm程度の大きさの良質な結晶が必要である.8）,9）電子線の強い相互作用は試料の厚みを著しく制限する図1微小で薄いタンパク質の結晶の光学顕微鏡像と電子顕微鏡像.（Images of tiny and thin crystals observedwith optical microscopy and cryo-electron microscopy.）（a）プロトン駆動力を外膜の基質輸送に利用する膜タンパク質ExbBDの結晶の光学顕微鏡写真（眞木ら，未発表）．これらの結晶はX線回折に用いるには小さすぎる．（b）氷包埋したカタラーゼの平板結5晶）の低温電子顕微鏡写真．ため，永らくタンパク質の三次元結晶からの構造解析は難しいと考えられてきたが，著者らのグループ10）とアメリカのグループ11）は，薄い三次元の結晶の電子線結晶構造解析が可能なことをそれぞれ示した．筆者らの解析では，電子線測定の最大の利点とも言える荷電状態に関する情報を得ることに成功している. 10）本稿では，電子線三次元結晶構造解析法の開発，構造解析，電荷を含む散乱因子の取り扱いなどについて，近年の低温電子顕微鏡法の単粒子解析の発展も踏まえ概説する．2．電子線回折上述のように，X線と比べて電子線は4～5乗も強く物質と相互作用するため,1）X線回折で利用できない微小88日本結晶学会誌第59巻第2・3号（2017）