ブックタイトル日本結晶学会誌Vol58No2

概要

日本結晶学会誌Vol58No2

92 日本結晶学会誌 第58 巻 第2 号（2016）松野明日香，田中良和の結晶をバッファーで溶解し，ネガティブ染色法にて透過型電子顕微鏡で観察したところ，10量体の構造が維持されていたのはそのうちの1つだけであった（図1B，C）．そこで，われわれはこの条件を基に結晶化条件を探索した．結晶化条件の最適化の過程で，血リンパを精製せずに用いると良質な結晶が得られること（SDS-PAGEでほかのタンパク質が確認されないほど高純度にヘモシアニンは血リンパ中に含まれる（図1A）），また，スルメイカの個体の違いにより結晶の質が大きく異なることが明らかになった（個体差については現在もその理由を明らかにできてはいないが，ヘモシアニンの糖鎖の種類が個体によって大きく異なることを筆者らは見出しており，おそらくそれが影響を与えているものと推察している）．そこで，筆者らは各々の個体から個別に採取した血リンパを用い，良質な結晶を与える個体をスクリーニングした．100パイ以上のイカを用いたスクリーニングの末，ようやく良質な個体を探すことができ，3.0 Aの分解能のX線回折データを収集することに成功した．SPring-8 BL38B1の顕微分光装置を用い，結晶の吸収スペクトルを測定したところ，酸素結合型ヘモシアニンに特有な345 nm付近の吸収が見られたことから，得られた結晶は酸素結合型のヘモシアニンであると判断した（図1D）．初期位相はクライオ電子顕微鏡により決定された貝由来ヘモシアニンのCαモデル6）を用いて決定した．最終的に，28,470 残基，80 個のCu2O2 クラスター，50 カ所の糖鎖修飾の原子構造を決定した．3．全体構造明らかになったスルメイカ由来ヘモシアニンの全体構造は，高さ約160 A，直径約350 Aの巨大な円筒状の10量体で，外側の外壁領域と内側に存在する5つの内部領域から構成されていた（図2A）．スルメイカ由来ヘモシアニンのサブユニットは8つのFUから構成されているが（FU-a，-b，-c，-d，-d*，-e，-f，-g），外壁領域はFU-a，-b，-c，-d，-e，-fにより構成され，一方，内部領域にはFU-d*，-g の2 つが含まれていた（図2B）．外壁領域は，上下対称に2回回転対称的に会合した2量体が，5回回転対称的に会合した構造（いわゆるD5の対称性）を有していたのに対し，内部領域は円筒の片側に5 回対称的に配置していた（いわゆるC5の対称性）（図2A，C）．すなわち，外壁領域は上下対称な構造であるのに対し，内部領域は上下非対称な構造をしていた．興味深いことに，結晶構造解析により確認された電子密度は，外壁領域のみならず内部領域も上下対称なD5の対称性を示していた（図2C）．これは，結晶中のヘモシアニンは外壁領域の接触のみで分子間相互作用しており，内部領域の構造は結晶のパッキングに無関係であったため，結果として，結晶中では上向きのコンフォメーションと，下外壁のみで接触し，内部領域の構造はパッキングに無関係(D)立体障害観測された構造（疑似のD5 対称性）結晶中で混在コンフォメーション2（C5 の対称性）FU-gCu2O2 of FU-d*コンフォメーション1（C5 の対称性）(C)FU-gprotomer BFU-g ofprotomer BCu2O2 of FU-d*円筒の内側から見た図180°FU-bFU-fFU-c FU-aFU-dFU-eprotomer B円筒の外側から見た図(B)protomer Aprotomer Cprotomer Bprotomer Iprotomer JB 90° DF HJprotomer Aprotomer Cprotomer Gprotomer E protomer I(A)図2 ヘモシアニンの構造．（Overall structure of hemocyanin.）（A）ヘモシアニンの全体構造．10 個のプロトマーから構成される円筒状の会合体である．プロトマーごとに色分けしている．（B）プロトマー中での各FUの配置．プロトマーAの各FUを色分けして表示した．見やすいようにプロトマーBも灰色で表示した．外壁領域にはFU-a，b，c，d，e，fが存在し，内部領域にはFU-d*，gが存在する．FU-d*については銅の位置だけが決定できた．（C）内部領域の構造．FU-gを水色，FU-d*のCU2O2クラスターをピンクで示した．結晶中では2 つのコンフォメーションが混在し，右のようなD5 対称の電子密度が観測された．（D）結晶中でのヘモシアニンのパッキング．外壁領域でのみ相互作用しているのがわかる．これらの図は，Elsevierの許可を得て文献8）から転載した．編集部注：カラーの図はオンライン版を参照下さい．