ブックタイトル日本結晶学会誌Vol57No6

概要

日本結晶学会誌Vol57No6

日本結晶学会誌 第57巻 第6号（2015） 321標的類似体と結合したCRISPR-Cas系Cmr複合体の結晶構造今回の解析から，Cmr複合体では，タグ配列内の2 番目のウリジンのみが塩基特異的に認識されることが判明した．一方，タグ配列内のほかのヌクレオチドに関しては，配列非特異的に結合しており，厳密な塩基特異性は確認されなかった．しかしながら，生体内には5’末端から2番目の位置にウリジンをもった非crRNA型のRNAが数多く存在するはずである．では，このようなRNAプールの中から，いかにしてcrRNAだけがCmr複合体に取り込まれるのであろうか？　最近の研究から，crRNA前駆体のプロセシングにかかわるCas6エンドリボヌクレアーゼがcrRNAのローディングに重要な役割を担うことが示唆されている．10），18）その詳しい原理はわかっていないが，Cas6がcrRNA前駆体をプロセシングする際に，Cmrタンパク質と一時的に相互作用することで，Cmrタンパク質がcrRNA上にリクルートされると推定される．これによって，2番目のウリジン以外には厳密な塩基特異性がないものの，crRNAのみがCmr複合体に効率良く取り込まれると考えられる．8．III型エフェクター複合体が標的RNAを切断するしくみ今回の解析から，crRNAのタグ配列がCmr複合体で固定されていることが判明した．このため，Cmr複合体はcrRNAの5’側から数えて一定距離にある14 番目，20 番目，26番目の塩基対合の形成を阻害する．その結果，これら3カ所において，標的RNAの構造が大きく歪んでCmr複合体の活性部位（Cmr4のAsp31の近傍）に配置され，6 塩基周期で切断されるしくみが明らかとなった（図6）．ChiCmrΔ1複合体には3分子のCmr4が含まれており，触媒残基であるAsp31は，約24 Aの間隔で周期的に配置されていた（図4a）．この距離は6 ntの核酸に相当する長さであり，Cmr4が6 ntの長さを測る分子定規として機能することも判明した．Cmr複合体から単離されたcrRNAには長さの異なる39 もしくは45 ntの2 種類が存在する．5）39 ntのcrRNAをもったCmr複合体は3分子のCmr4を，一方，45 ntのcrRNAをもったCmr複合体は4分子のCmr4を含むと示唆され，Cmr4のサブユニット数がcrRNAの長さの多様性を生み出すと考えられる．また，Cmr複合体の活性部位の数はCmr4のサブユニット数と一致するため，それぞれのCmr複合体は標的RNAを3 カ所または4 カ所で切断すると考えられる．実際，45 ntのcrRNAを含むCmr複合体は，標的RNAを4カ所で切断する．14），15）III-A型のエフェクター複合体であるCsm複合体は5種類のCasタンパク質（Csm1 ～ Csm5）とcrRNAから構成されている．Csm3の立体構造はCmr4と類似しており，19），20）thumbに相当する領域（結晶構造ではdisorder していた）をもつことが示唆される．Csm複合体のクライオ電子顕微鏡による解析から，複数個のCsm3が規則的に積み重なりCmr複合体と類似したらせん状の溝を形成することが判明している．10），13）また，触媒反応にかかわるCmr4のアスパラギン酸残基がCsm3においても高度に保存されており，そのアミノ酸を置換した変異型Csm複合体が標的RNAに対する切断活性を消失することが報告されている．6）さらに，Csm4の立体構造がCmr3に類似することがわかり，20）Cmr3と同様にCsm4が複合体の基底部においてcrRNAのタグ配列の認識にかかわると考えられる．したがって，Csm複合体もCmr複合体とまったく同じしくみで標的RNAの切断部位を選び出すと考えられ，標的RNAを分解するしくみがIII型エフェクター複合体の種類にかかわらず共通していることが示唆される．9．I 型およびIII型エフェクター複合体の分子進化I型エフェクター複合体であるCascadeは，crRNAと5 種類のCasタンパク質（Cse1，Cse2，Cas5，Cas6，Cas7）が1：2：1：1：6 のストイキオメトリーで会合した複合体である．9）立体構造の比較から，Cmr4とCas7が，また，Cmr3とCas5の構造がそれぞれ類似していることが明らかとなった．また，Cmr複合体の場合と同様に，Cascadeでは，Cas5がcrRNAのタグ配列を特異的に認識し，6 分子のCas7がガイド配列との相互作用に関与していた．9）このため，CascadeとCmr複合体において，これらのタンパク質の空間的な配置が類似しており，その結果，I 型とIII 型エフェクター複合体はよく似た立体構造をとることがわかった（図7）．さらに，Cas7にもthumb領域が存在図6 Cmr複合体が標的RNAを切断するしくみ．（TargetRNA cleavage mechanism by the Cmr complex.）