ブックタイトル日本結晶学会誌Vol57No4

概要

日本結晶学会誌Vol57No4

姚閔，中澤祐人codonを結合するanti-codon認識ドメイン，機能未知の挿入ドメインからなり，機能単位である4量体を形成している．また，SepRSとtRNAの複合体構造，および私たちの結合実験から，機能単位の4量体には2個のtRNAが結合していることがわかった．一方，A. fulgidus由来のSepCysS構造も得られ，2量体が形成されていることがわかった（PDBID：2E7J）．8）その構造には，大腸菌の発現系から捕獲したPLPが活性部位に結合していた．また，変異体の解析により，保存性の高い3つのアミノ酸残基R79，H103，Y104がSepCysSの反応に重要であることもわかった．9）2段階の反応では，中間体として生産されるSeptRNACysが生体内で遊離されると，リボソームにおける翻訳は正しく行われなくなり，タンパク質の合成の正確さが問題となる．よって，アミノアシルtRNAのほかの間接反応経路と同様に，2段階の反応は，終了しないとtRNA Cysを遊離させないように，SepRSとSepCysSが複合体を形成して機能すると提案されている．10）1.2間接経路におけるCys-tRNA Cysの合成に必要な新規因子ここまで，遊離のCysをもっていない古細菌では，CystRNACysの合成はSepRS，SepCysSが共同して働くことによって2段階反応を経て完成することを説明した．しかし，興味深いことに，in vitroの実験では，SepRSとSepCysSのみが存在する系では，Cys-tRNA Cysは合成されないことがわかった（図2a）．11）そこで，共同研究者であるYale大学のLiu博士は，Pull-downアッセイおよび質量分析によって，間接経路を用いたCys-tRNA Cysの合成に関与する24 kDaの分子量を有する新規因子を発見し，SepCysE（SepRS/SepCysS pathway enhancer）と名前図2 in vitroのCys-tRNA Cysの合成．（The Cys-tRNA Cyssynthesis in vitro.）（a）両酵素SepRSとSepCysSのみを用いた合成の実験，（b）新規因子SepCysEを加えた実験の結果．をつけた（図2b）．12）このSepCysEは間接経路におけるCys-tRNA Cys合成には必要であり，このような間接経路を有する菌によく保存され，菌の生存にも必須である．しかし，類似性の高いタンパク質は存在せず，機能・構造についてはまったく未知であり，この因子が関与するCys-tRNA Cysの合成の分子機構も不明であった．われわれは，古細菌Methanocaldococcus jannaschii由来の新規因子SepCysEとSepCysSの複合体のX線結晶構造解析を行い，得られた構造情報を手掛かりとしたアプローチで，新規因子SepCysEの機能を明らかにした．また，生化学実験と小角散乱の結果を加えて，この3個のタンパク質が関与するCys-tRNA Cys分子基盤を提案することができた．12）2．SepCysS-SepCysEの結晶構造解析われわれは，大腸菌B834（DE3）を用いて，M. jannaschii由来のSepCysSとSepCysEを共発現し，Ni-affinity，Heparin，Size-exclusion chromategraphy（SEC）を用いて，高純度に精製した．それから，結晶化のスクリーニングを行い，初期結晶を得た．さらに，結晶化バッファーのpH，沈殿剤の濃度，結晶化条件の最適化を行い，2.8 A分解能の回折能をもつ結晶を得ることができた．放射光施設にて回折データを測定し，プログラムXDSによりデータを処理した．SepCysS-SepCysE複合体の結晶は空間群P6 5に属し（a＝b＝106.9，c＝495.2 A），merohedral twinであった．Phenix_xtriageを用いて回折データを分析した結果，その結晶のtwin-operatorとtwin-factorはそれぞれ（h，-h-k，-l）と0.45であることがわかった．SepCysS-SepCysE複合体の位相計算は分子置換法を用いて行った．サーチモデルとして，A. fulgidus由来のSepCysSの2量体構造（PDBID：2E7J）8）を使用した．分子置換法の解が得られた後に，2Fo-FcマップとFo-FcマップにSepCysEの一部分が見えた．そして，Phenix_refineと連動する自動精密化プログラムLafireを用いて，精密化しながら，SepCysEのモデル構築を行い，最終的に，SepCysEのN末端I34-F102残基のモデルを構築することができた（PDBID：3WKR）．また，精密化には，twin-operatorを加え，twin-factorの精密化も行い，Rfree/R値は24.3／22.4％まで収斂した．得られたSepCysS-SepCysE複合体の構造情報に基づいてSepCysSとSepCysEのN末端残基I34-F102の部分のみSepCysE（NTD）を調製し，SepCysSとの複合体SepCysS-SepCysE（NTD）の，空間群P2 12 12 1の結晶を得て，3.0 A分解能での構造を得た（PDBID：3WKS）．得られたSepCysS-SepCysE（NTD）の構造は，SepCysS-SepCysEとほぼ同じであったため，以下の議論は，SepCysS-SepCysEの構造に基づいて行う．246日本結晶学会誌第57巻第4号（2015）