ブックタイトル日本結晶学会誌Vol56No4

概要

日本結晶学会誌Vol56No4

構造から見るジフテリア菌由来ヘム分解酵素のヘム取り込みと反応最終段階のメカニズム図3ビリベルジンの構造.（Structure of biliveridn.）A.ヒトHO-1複合体構造中に見られるビリベルジン構造との比較, B.ビリベルジンに対する電子密度図（Omit map）.の作製の仕方も異なるうえ,哺乳類のHO-1のほうが,ヘム結合ポケットの内部がHmuOより大きいという違いもあるが,ヒトHO-1の論文の図から判断すると,ビリベルジン結合型の安定な状態の構造解析には成功しておらず,無理矢理モデルを当てはめているように見える）. 9) HmuO結晶の非対称単位中の2分子（A, B分子）では,ビリベルジンの一部の原子の温度因子がやや高い.それは,中心に鉄を含むヘムがHis20と配位結合を形成していたのとは異なり,酵素と直接水素結合をしているのがプロピオン酸のうち一方のみで, His20が水分子を介しての間接的な水素結合という弱い結合をしているだけであるからだろう.そのため,溶媒（表面）に近いほうはどうしても揺らぎがある.しかし,非対称単位中の残りの1分子（C分子）では,ビリベルジンの電子密度は明瞭であった（図3B）.興味深いことに,電子供与体として使ったアスコルビン酸が,ビリベルジンとHis20の間に入り込み,ビリベルジンの揺らぎが大きい溶媒側の構造を支えるような結合をしていた.これが何を意味しているのかは不明だが,電子の供給日本結晶学会誌第56巻第4号（2014）経路などと関係があるのかもしれない. C分子の電子密度が一番明瞭だった（図3）が,アスコルビン酸の有無の違い以外は, A分子, B分子の構造もC分子とほぼ同じであった. C分子のアスコルビン酸の1つのO原子（O3）に相当する位置に, A, B分子では水が入り込んで, His20とビリベルジンを水素結合でつないでいた.なぜC分子だけそこにアスコルビン酸が見られるのかは不明で,結晶内の分子パッキングによる環境の違いとしか答えられない.生体ではアスコルビン酸で還元反応が行われるわけではないので, C分子の構造はartifactであり, A, B分子の構造が生体内での構造と言える.遠位側ポケットの水分子は明瞭に同定でき,必須のアミノ酸であるAsp136を含んだ水素結合ネットワークを形成していた.ビリベルジンのラクタム酸素原子が,水分子の1つと水素結合で結合していた（図2）. 16)2.4 HmuOヘム分解最終段階反応中間体の構造2.4.1結晶の作製Fe 3+ -ビリベルジン複合体は,ヘム結合型HmuO結晶からビリベルジン結合型を得た方法と類似の方法で,アスコルビン酸含有溶液への結晶ソーキング時間を短縮して得た.また,アスコルビン酸の濃度を落としたうえに,反応を阻害するアジドを加えることで,鉄が抜けていく途中の中間体の結晶を得た.これは,当初ベルドヘム中間体結晶を得るために行っていたが,この方法ではベルドヘムの集積は見られず,次の段階に進行してしまった（ちなみに,ベルドヘム中間体の構造は別の再構成の実験で得て,報告済みである）. 12),18),19)これら両者の中間体結晶を得るためには,ソーキング溶液が浸透していく結晶の中で場所による時間差ができるだけ小さくなるように,できるだけ薄い板状で小さな結晶を選択した.結晶を凍結させるまでの反応液へのソーキング時間も多条件試したが,時間には単純に依存せず（おそらく結晶の新鮮さ,微妙な体積の違いもかかわり）,回折実験と構造解析を繰り返して電子密度図を見て判断した.また,非対称単位中の3分子の間にも,反応性の違いは見られた.結晶中の分子パッキングによる各分子の環境の違いによるものと思われる.それぞれの構造を決定した結晶の回折実験は, PF BL5AとSPring-8 BL38Bで行った.分解能はそれぞれ1.90, 1.70 Aであった. 16)2.4.2 Fe 3+ -ビリベルジン結合型HmuOの構造ベルドヘム中間体からビリベルジンを生成する反応の途中では, Fe 3+ -ビリベルジンが見られる.さまざまな条件で実験を行ううちに,反応がビリベルジン生成まで到達せず,鉄に相当する電子密度が残っている分子を含む結晶を得ることに成功した.Fe 3+ -ビリベルジン複合体の構造は,すでにラットHO-1で報告されているが, 17) HmuOの解析では,分解能が上がり,プロピオン酸側鎖まで見えたこと,またHis20の電子273